نکات اساسی برای محافظت از کشت سلولی

نکات اساسی برای محافظت از کشت سلولی

سلولها متابولیسم خود را در طول فعالیتهای رشد طبیعی ادامه می دهند ، که نیاز به مشارکت پروتئازهای مختلف دارد. هنگامی که درجه حرارت زیر 70 درجه سانتیگراد کاهش می یابد ، پروتئازها کار را متوقف می کنند. بنابراین ، در محیطی با دمای بسیار پایین ، سلول ها می توانند فعالیت های متابولیکی خود را متوقف کرده و وارد حالت خفته ای شوند که امکان ذخیره طولانی مدت را فراهم می کند.

1. مواد آزمایشی

مادهء اصلی:

واسطه

سرم (FBS/NBS معمولی)

میز کار Ultrapure

دی متیل سولفوکسید استریل (DMSO)

محلول نمک بافر فسفات استریل استریل

اسلحه

اسلحه برقی

تهیه آزمایشات

الف) تهیه راه حل انجماد:

سلولهای عمومی: 55 ٪ محیط پایه + 40 ٪ سرم گاو (FBS/NBS) + 5 ٪ DMSO

سلولهای حیاتی: 90 ٪ سرم گاو (FBS/NBS) + 10 ٪ DMSO

Aliquot محلول محافظت از cryopreservation را در یک لوله سانتریفیوژ 15 میلی لیتری [لانه] قرار داده و برای استفاده بعدی در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره کنید.

(ب) آماده سازی سلولها برای یخ زده:

قبل از انجماد سلول ها ، سلولهایی را با وضعیت رشد خوب و در مرحله رشد لگاریتمی انتخاب کرده و آنها را با متوسط ​​12-24 ساعت قبل از انجماد جایگزین کنید تا وضعیت سلول حفظ شود.

2. روش تجربی

1. چگالی سلول ها را یخ زده مشاهده کنید ، که حدود 80 ~ 90 ٪ است. از اسلحه پیپت برای آسپیراسیون محیط قدیمی استفاده کنید ، PBS استریل را برای شستن سلول ها 1-2 بار اضافه کنید و محیط باقی مانده را در محیط کشت جدا کنید.

2. مقدار مناسب تریپسین یا آب گوارشی را اضافه کنید تا تریپسین وارد سلول شود و آنها را برای هضم در دستگاه جوجه کشی قرار دهید. وضعیت سلول های زیر میکروسکوپ را رعایت کنید: سیتوپلاسم در حال جمع شدن است و سلول ها دیگر به ورق ها وصل نمی شوند. در این مرحله ، راه حل توقف را برای متوقف کردن روند هضم اضافه کنید.

3. سلولها را با نوک به آرامی حباب کنید تا یک سیستم تعلیق سلول ایجاد شود و سیستم تعلیق سلول را در 1000 دور در دقیقه به مدت 3-5 دقیقه سانتریفیل کند.

مایع رویی را دور بیندازید ، مقدار مناسبی از محلول انجماد و پیپت را به آرامی اضافه کنید تا سلول ها به طور یکنواخت حساب شوند. چگالی سلول را با محیط محافظت از cryopresing تنظیم کنید تا چگالی نهایی 5 × 106/میلی لیتر ~ 1 × 107/میلی لیتر انجام شود.

4- برای جدا کردن لوله های کرایوژنیک با توجه به ظرفیت مورد انتظار ، از اسلحه پیپت استفاده کنید و از یک دستگاه پوشش اتوماتیک برای کلاه و مهر و موم استفاده کنید.

5- برنامه استاندارد محافظت از cryopresing یک سرعت خنک کننده -1 درجه سانتیگراد تا 2 درجه سانتیگراد در دقیقه است و سلول هایی که باید منجمد شوند با توجه به مراحل زیر به تدریج یخ زده می شوند: دمای اتاق → 4 درجه سانتیگراد (20 دقیقه) - - - 20 درجه سانتیگراد (30min) → -80 ° C ° C (یک شب) → ذخیره طولانی مدت در نیتروژن مایع.

همچنین می توان آن را مستقیماً در یک فریزر در دمای 80 درجه سانتیگراد یک شبه ذخیره کرد و سپس برای ذخیره سازی به نیتروژن مایع منتقل کرد.

Yongyue Medical یک شرکت فناوری پیشرفته است که متخصص در زمینه تحقیق و توسعه ، تولید و فروش مواد مصرفی زیست پزشکی است. نکات پیپت ، پیپت ، صفحه PCR ، محصولات کشت سلولی و سایر مواد مصرفی آزمایشگاهی بیولوژیکی. Yongyue Medical شایسته اعتماد و انتخاب شما است! به مشاوره خوش آمدید!